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紫外分光光度计的使用原理和方法

  紫外分光光度计的使用原理和方法_医药卫生_专业资料。紫外分光光度计的使用原理和方法

  紫外分光光度计的使用原理和方法 紫外-可见吸收光谱 朗伯-比耳定律 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 测定方法 在医学检验中的应用 紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) 它是利用物质的分子或离子对某一波 长范围的光的吸收作用,对物质进行定性 分析、定量分析及结构分析, 所依据的光 谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的 光而产生的吸收光谱。 按所吸收光的波长区域不同,分为紫外 分光光度法和可见分光光度法,合称为紫外可见分光光度法。 紫外-可见分光光度法的特点: 1 与其它光谱分析方法相比,其仪器设备和 操作都比较简单,费用少,分析速度快; 2 灵敏度高; 3 选择性好; 4 精密度和准确度较高; 5 用途广泛。 §1. 紫外-可见吸收光谱 1. 物质对光的选择性吸收 物质对光的吸收是选择性的,利用 被测物质对某波长的光的吸收来了解物 质的特性,这就是光谱法的基础。 通过测定被测物质对不同波长的光的吸 收强度(吸光度),以波长为横坐标,吸光 度为纵坐标作图,得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线; 在吸收曲线中,通常选用最大吸收波长 λmax进行物质含量的测定。 2 有机化合物的紫外-可见吸收光谱 2.1 有机化合物的电子跃迁 与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三 种,即形成单键的σ电子、形成双键的π电 子以及未参与成键的n电子。 跃迁类型有:σ σ*、n σ* 、π π *、 n π * 四种。 饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*, n→σ* 跃迁,吸收峰一般出现在真空紫外区, 吸收峰低于200nm,实际应用价值不大。 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*, π→π* 跃迁,吸收峰一般大于200nm。 生色团:是指分子中可以吸收光子而产生电 子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、 可见光的原子团或结构系统定义为生色团。 见表3-1和3-2。 助色团:是指带有非键电子对的基团,如OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等, 它们本身不能吸收大于200nm的光,但是当 它们与生色团相连时,会使生色团的吸收峰 向长波方向移动,并且增加其吸收强度。见 表3-4。 红移和紫移 在有机化合物中,常常因取代基的变更 或溶剂的改变,使其吸收带的最大吸收波长 λmax发生移动。向长波方向移动称为红移(表33),向短波方向移动称为紫移。 2.2 有机化合物的吸收带 吸收带(absorption band): 在紫外光谱中,吸 收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分 子轨道的种类,可将吸收带分为四种类型。 (1) R吸收带 (2) K吸收带 (3) B吸收带 (4) E吸收带 3 无机化合物的紫外-可见吸收光谱 1. f电子跃迁吸收光谱 镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的 吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其 紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰, 这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影 响。 2. d电子跃迁吸收光谱 过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨 道间的跃迁,吸收紫外或可见光谱。这些峰 强烈受配位环境的影响。 例如 cu2+以水为配位体,吸收峰在794nm 处,而以氨为配位体,吸收峰在663nm处。此 类光谱吸收强度弱,较少用于定量分析。 3. 电荷迁移光谱 某些分子既是电子给 体,又是电子受体,当电子受辐射能激发 从给体外层轨道向受体跃迁时,就会产生 较强的吸收,这种光谱称为电荷迁移光谱。 如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应。 1.4 影响紫外-可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。 测定条件(温度、溶剂极性、pH等)不同, 吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度 等都可能发生变化。 1.温度 在室温范围内,温度对吸收光谱的影 响不大。 2. 溶剂 注意如下几点: (1)尽量选用低极性溶剂; (2)能很好地溶解被测物,并且形成的溶液 具有良好的化学和光化学稳定性; (3)溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。 3. pH值 1.5 紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量 分析外,还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、 结构分析。 1.定性分析 2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方 便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中,可用 A280/A260的比值,鉴定其纯度。 3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物 的结构分析,但利用紫外吸收光谱鉴定化 合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定 价值。 例如,某化合物在近紫外区内无吸收,说 明该物质无共轭结构和芳香结构。 §2. 朗伯-比尔定律 一、吸光度和透光度 设入射光强度为I0,吸收光强度为Ia,透 射光强度为 It,反射光强度为Ir,则 I0= Ia+ It+ Ir 由于反射光强度基本相同,其影响可相互抵 消,上式可简化为: I0= Ia+ It 透光度:透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比,用T表示: 即 T= It/I0 吸光度: 为透光度倒数的对数,用A表示, 即 A=lg1/T=lgI0/It 二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律:当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时,溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比,即 A= κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性,入射光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度,l 为透光液层厚度。 朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的 理论基础。 三、吸光系数 当l以cm,c以g/L为单位,κ称为吸光 系数,用 a表示。 A= a cl a的单位为L/(g.cm) 摩尔吸光系数 当l以cm,c以mol/L为单位,κ称为摩尔 吸光系数,用 ε表示。 ε的单位为L/mol.cm,它表示物质的浓度 为1mol/L,液层厚度为1cm时,溶液的吸光 度。 比吸光系数 比吸光系数是指百分含量为1%, l为1cm 1% 时的吸光度值,用 E1cm 表示。 ? ? 0.1M r E 1% 1cm 四、偏离朗伯-比耳定律的因素 (1)入射光为非单色光 (2)溶液的不均性。 实际样品的混浊,加入的保护胶体,蒸 馏水中的微生物,存在散射以及共振发射 等,均可吸光质点的吸光特性变化大。 (3)光程的不一致性。 光源不是点光源,比色皿光径长度不一 致,光学元件的缺陷引起的多次反射等,均 造成光径不一致,从而与定律偏离。 §3. 紫外-可见分光光度计 一、主要部件的性能与作用 基本结构: 光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品 1 光源 在紫外可见分光光度计中,常用的光源 有两类:热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源用于可见光区,如钨灯和 卤钨灯;气体放电光源用于紫外光区,如 氢灯和氘灯。 2 单色器 单色器的主要组成:入射狭缝、出射狭 缝、色散元件和准直镜等部分。 单色器质量的优劣,主要决定于 色散元件的质量。色散元件常用棱镜 和光栅。 3 吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯,按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池,前 者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多,其光径可在 0.1~10cm之间,其中以1cm光径吸收池 最为常用。 4 检测器 检测器的作用是检测光信号,并将光 信号转变为电信号。现今使用的分光光度 计大多采用光电管或光电倍增管作为检测 器。 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计, 电位调节指零装置,以及自动记录和数 字显示装置等。 5 二、紫外-可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光 度计和双波长分光光度计。 1.单波长单光束分光光度计 目前国内广泛采用721型分光光度计。 具有结构简单、价格低廉、操作方便、 维修也比较容易,适用于常规分析。 单波长单光束分光光度计还有国产 751型、XG-125型、英国SP500型和伯 克曼DU-8型等。 2.单波长双光束分光光度计 单波长双光束分光光度计有国产710型、 730型、740型、日立UV-340型等就属于这 种类型。 3.双波长分光光度计 双波长分光光度计的优点:是可以在有 背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下 对某组分进行定量测定。 国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、 UV-265型等。 三、分光光度计的校正和检验 1.波长校正 2.吸光度校正 3.杂散光的检验 4.稳定性的检验 §4 分析条件的选择 一、 仪器测量条件的选择 1.适宜的吸光度范围 由朗伯-比尔定律可知: A=lg1/T=εcl 微分后得: dlgT=0.4343dT/T= -εldc 或 0.4343ΔT/T= -εlΔc 代入朗伯-比尔定律有: Δc/c=0.4343ΔT/TlgT 要使测定的相对误差Δc/c最小,求导取极 小得出: lgT=-0.4343=A 即当A=0.4343时,吸光度测量误差最小。 最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。 2.入射光波长的选择 通常是根据被测组分的吸收光谱,选择 最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当 最强吸收峰的峰形比较尖锐时,往往选用吸 收稍低,峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测 定。 3. 狭缝宽度的选择 为了选择合适的狭缝宽度,应以减少 狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。 一般来说,狭缝宽度大约是试样吸收峰半 宽度的十分之一。 二、显色反应条件的选择 对多种物质进行测定,常利用显色反 应将被测组分转变为在一定波长范围有吸 收的物质。常见的显色反应有配位反应、 氧化还原反应等。 这些显色反应,必须满足以下条件: 1.反应的生成物必须在紫外-可见光区有较 强的吸光能力,即摩尔吸光系数较大; 2.反应有较高的选择性,即被测组分生成 的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱 有明显的差别; 3. 反应生成的产物有足够的稳定性,以保 证测量过程中溶液的吸光度不变; 4.反应生成物的组成恒定。 1.酸度 显色反应最适宜的酸度范围可通过实 验来确定:测定某一固定浓度的试样的吸 光度随酸度的变化,以吸光度为纵坐标, 溶液的PH值为横坐标作图。 2.显色剂的用量 3.显色时间和温度 三、参比溶液的选择 测定试样溶液的吸光度,需先用参比 溶液调节透光度(吸光度为0)为100%,以 消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反 射和吸收带来的测定误差。 参比溶液的选择视分析体系而定,具体有: 1.溶剂参比 试样简单、共存其它成分 对测定波长吸收弱,只考虑消除溶剂与吸 收池等因素; 2.试样参比 如果试样基体溶液在测定 波长有吸收,而显色剂不与试样基体显 色时,可按与显色反应相同的条件处理 试样,只是不加入显色剂。 3.试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 测定波长有吸收,按显色反应相同的条件, 不加入试样,同样加入试剂和溶剂作为参 比溶液。 4. 平行操作参比 用不含被测组分的试 样,在相同的条件下与被测试样同时进 行处理,由此得到平行操作参比溶液。 §5 测定方法 一、 单组分定量方法 单组分是指样品溶液中含有一种组分, 或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰 与其他共有物质的吸收峰无重叠。 其定量方法包括校准曲线法、标准对比 法和吸收系数法。 1 校准曲线法 方法:配制一系列不同含量的标准溶液,选 用适宜的参比,在相同的条件下,测定系列 标准溶液的吸光度,作A-c曲线,即标准曲 线,也可用最小二乘数处理,得线性回归方 程。 在相同条件下测定未知试样的吸光度, 从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试 样的浓度。 2 标准对比法 即将待测溶液与某一标样溶液,在相同 的条件下,测定各自的吸光度,建立朗伯比尔定律,解方程求出未知样浓度与含量。 As=Kcs Ax=Kcx cs Ax cx ? As §6 紫外-可见分光光度法在医学检验中的应用 例1.血清铜的测定 例2.新生儿血清胆红素的测定

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